Comparison and Improvement of Total RNA Extraction Methods from Different Tissues of Polygonatum cyrtonema Hua. 

Zhang Ying ², Luo Xiaomeng ³, Luo Xingju ², Zhang Shuili ¹, Wang Hong ¹, Zhang Chunchun ¹, Fan Huiyan ^1 *

1 College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou, 310053, China

2 College of Binjiang, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou, 310053, China

3 Taizhou Traditional Chinese Medicine Hospital, Taizhou, 318020, China

^* Corresponding author, huiyanfan@126.com

Abstract Extraction and isolation of high-quality RNA from Polygonatum cyrtonema Hua. is the basis of research on gene expression, regulation and genetic engineering. For screening the best method of total RNA extraction from different tissues of P. cyrtonema, total RNA was extracted from rhizomes, stems, leaves and flowers of P. cyrtonema by six methods that were Trizol method, CTAB-isopropanol method, RNA pure plant kit CTAB-LiCl method, hot phenol method and improved hot phenol method respectively. The concentration and quality of RNA were analyzed using Subordinate function method. The results showed that the improved hot phenol method was the most ideal for RNA extraction among the six methods. The RNA bands of different tissues of P. cyrtonema were complete and clear, the OD₂₆₀/OD₂₈₀ and OD₂₆₀/OD₂₃₀ values were between 1.8 and 2.1, the extraction concentration values were between 77.16 and 185.72 µg/g. This study provide a reference for extracting high-quality total RNA from P. cyrtonema.

Keywords Polygonatum cyrtonema Hua.; RNA extraction; Improved hot phenol method; Subordinate function method

多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)是百合科黄精属多年生草本植物，兼具观赏、食用、药用和美容价值(周建金等, 2013)，是极具发展前景的中国特有药用植物之一。多花黄精在民间用药中应用广泛，具有补气养阴、健脾、润肺、益肾等功效，有“血气双补之王”的美誉(彭小博等, 2017)，临床上可用于脾胃气虚，体倦乏力，胃阴不足，口干食少，肺虚燥咳，腰膝酸软等病症(王婷等, 2015; 陈辉等, 2015; 罗敏等, 2016)。随着多花黄精药用价值研究的广泛应用，其人工栽培研究广受关注。通过对多花黄精多糖、黄酮等次生代谢产物合成途径关键酶基因表达及基因转录组的分析可为人工种植条件的优选提供依据(柯红梅, 2013; 李瑞勤等, 2017)。分子生物学实验需要大量高质量的RNA，由于多花黄精样品富含多糖等二次代谢产物，常用的RNA提取方法不能有效应用于多花黄精不同组织总RNA提取。而商业试剂盒不仅价格昂贵，而且提取的总RNA质量不佳。

隶属函数是模糊数学中的基本概念，目前广泛用于作物抗旱、耐盐碱、耐阴、耐湿等抗逆性状的综合评价(刘小艳等, 2010)。而评价RNA质量优劣一般采用分析OD₂₆₀/OD₂₈₀、OD₂₆₀/OD₂₃₀和RNA得率等指标的方法，缺乏综合性评价方法。由于RNA质量的各评价指标在优劣之间是渐变的，具有模糊性，因此应用模糊数学中的隶属函数法评价RNA质量可得到科学的评价结果。本研究以多花黄精的根茎、茎、叶和花为材料，采用Trizol法、CTAB-异丙醇法、天根RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒法、热酚法、CTAB-LiCl法和改良热酚法6种方法提取总RNA，应用隶属函数法辅助比较不同提取方法所得总RNA完整性和得率，优选出经济、快速、可以从多花黄精的各个组织中提取高质量总RNA的提取方法，为多花黄精后续分子生物学实验的开展提供参考依据。

1结果与分析

1.1不同方法提取多花黄精总RNA质量分析

本研究通过观察琼脂糖凝胶电泳后出现的条带，可以分析不同方法提取的总RNA完整性、降解程度以及污染情况。得出不同方法提取多花黄精不同组织RNA的琼脂糖凝胶电泳图谱(图1)。CTAB-异丙醇法提取的RNA条带模糊，完整性较差，且有DNA污染，说明其有明显降解现象；CTAB-LiCl法提取的多花黄精叶、茎RNA条带清晰，花RNA条带有拖尾现象，同时各条带存在DNA污染情况；热酚法的叶、花和茎的电泳图谱条带较为明亮清晰，说明其完整性较好，但有轻微的拖尾现象，且存在轻微的DNA污染；试剂盒法提取的叶、花RNA条带均具有明显的拖尾现象，说明其可能有轻微降解；Trizol法提取的RNA条带模糊，说明其浓度很低且发生了降解；改良热酚法提取多花黄精不同部位的RNA均有清晰明亮的28S、18S和5S条带，说明改良热酚法提取的RNA完整性好，且无明显降解现象。

1.2不同方法提取多花黄精总RNA纯度和得率分析

不同方法提取多花黄精不同组织RNA的纯度和浓度数据可知(表1)，CTAB-异丙醇法提取不同部位RNA的纯度不理想，且提取叶、花、茎RNA得率较低；CTAB-LiCl法对叶、茎RNA提取效果较好，OD₂₆₀/OD₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₃₀值均在2.0左右，但提取的根茎和花RNA得率较低；热酚法提取RNA的OD₂₆₀/OD₂₃₀值均大于2.2，且提取的根茎RNA得率低；Trizol法提取的叶、根茎、茎RNA纯度和浓度均不理想，其中茎浓度低至12.9 µg/g；天根试剂盒法提取RNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀值均在1.8~2.1之间，但提取的RNA得率低，其中茎RNA得率低至19.6 µg/g。上述方法提取效果均不佳，而改良热酚法提取RNA的纯度高，OD₂₆₀/OD₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₃₀值均在1.8~2.1。并且RNA的得率均较高，提取浓度在77.16~185.72 µg/g，可适用于多花黄精不同组织的总RNA提取。

方差分析结果表明，不同提取方法之间的OD₂₆₀/OD₂₈₀、OD₂₆₀/OD₂₃₀和RNA得率均存在极显著性差异(p＜0.01)。在OD₂₆₀/OD₂₈₀上，与改良热酚法相比，CTAB-LiCl法和试剂盒法均存在极显著性差异；与Trizol法相比，CTAB- LiCl法和天根试剂盒法均存在显著性差异。在OD₂₆₀/OD₂₃₀上，热酚法和除CTAB-LiCl法以外的其余4种提取方法均具有显著性差异，改良热酚法和热酚法这两种方法均与试剂盒法间存在极其显著性差异。从RNA得率上来看，改良热酚法与试剂盒法存在显著差异(表2)。

1.3应用隶属函数法对不同方法提取的总RNA综合分析

通过计算分别得到6种提取方法的隶属函数值结果(表3)。隶属函数平均值越大，表明该提取方法下提取的RNA质量越高。分析结果表明，在OD₂₆₀/OD₂₈₀上提取方法的优劣顺序为 CTAB-LiCl法＞改良热酚法＞热酚法＞试剂盒法＞Trizol法＞CTAB-异丙醇法；在OD₂₆₀/OD₂₃₀上提取方法的优劣顺序为改良热酚法＞热酚法＞CTAB-LiCl法＞CTAB-异丙醇法＞Trizol法＞试剂盒法；在RNA得率上提取方法的优劣顺序为热酚法＞改良热酚法＞CTAB-异丙醇法＞Trizol法＞CTAB-LiCl法＞天根试剂盒法。

综合OD₂₆₀/OD₂₈₀、OD₂₆₀/OD₂₃₀和RNA得率3个指标评判结果，改良热酚法提取的总RNA质量的平均隶属函数值最高，为0.764；试剂盒法的平均隶属函数值最低，为0.504；提取方法的优劣顺序依次为改良热酚法＞热酚法＞CTAB-LiCl法＞CTAB-异丙醇法＞Trizol法＞试剂盒法。

1.4不同方法提取多花黄精总RNA的成本比较分析

综合比较CTAB法、Trizol法等6种RNA提取方法的操作复杂程度、实验时长、经济成本以及提取的总RNA完整性和得率，分析6种方法的优缺点(表4)。Trizol法作为一种操作简单、且时间成本低的传统RNA提取工艺，能够有效提取多花黄精花、茎部分RNA。但由于多花黄精叶、根茎部位次生代谢产物含量丰富，因此用此法提取到的叶、根茎总RNA完整性不佳且得率低；CTAB-LiCl法是提取植物组织RNA的传统工艺之一，其经济成本低，但操作繁琐、耗时长。可能由于步骤多且耗时长的原因，导致提取RNA易出现降解，该法提取多花黄精叶、根茎、花部位的效果均不佳；CTAB-异丙醇法与CTAB-LiCl法相比，RNA沉淀步骤不同，采用异丙醇沉淀RNA减少了提取的时间成本，但提取效果依然不佳，该法提取不同部位多花黄精的RNA完整性差且得率低；热酚法在提取植物组织RNA时经常使用，经济成本低，操作步骤简单，但时间方面的成本较高，由于多花黄精根茎部位多糖多酚产物含量丰富，此法提取的多花黄精根茎部位RNA产量较低；天根RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒法适用于富含次生代谢产物的植物组织RNA提取，其操作繁琐程度中等，操作时间较短，但经济成本很高，在实际应用中多花黄精不同部位RNA提取的效果一般且根茎RNA得率低；改良热酚法在热酚法的基础上增加了RNA的进一步纯化步骤，操作繁琐程度一般，经济成本低廉，该法提取的多花黄精不同组织RNA完整性好且纯度和得率都较高。

2讨论

提取出高质量RNA是分析基因表达分析的关键性步骤，也同样是研究转录组测序、RT-PCR等后续分子研究不可或缺的步骤(Tong et al, 2012; Kim et al, 2014)。多花黄精是典型的富含多糖多酚类次生代谢产物的植物材料，尤其是其根茎部分，从这类植物中提取高质量RNA的难度较大(Wang et al, 2005)，且其不同组织部位内的次生代谢产物成分含量均有差异(Ainsworth, 1994)，进一步影响了多花黄精不同部位高质量RNA的提取效率。作为需求量极大但人工种植规模小的根茎类药材，多花黄精的多糖、黄酮等次生代谢产物合成途径关键酶基因表达及转录组分析可为人工种植条件的优选提供依据。但多花黄精等传统中药材的基原植物在分子生物学上的研究目前尚处于初始阶段，且尚无针对多花黄精不同组织RNA提取方法的研究。RNA提取过程中最主要的问题就是降解和污染，在富含多糖多酚的黄精组织中，要获得完整性好的RNA，最关键的就是植物细胞的破碎必须完全充分且迅速(魏环宇, 2019)。

本研究采用Trizol法、CTAB-异丙醇法、CTAB-LiCl法、热酚法、天根RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒法和改良热酚法提取多花黄精根茎、茎、叶和花部位的总RNA，并结合隶属函数法分析，研究发现，Trizol法提取的RNA质量较差，可能由于其与多酚类物质和核酸大分子的不可逆结合造成了RNA损失；CTAB-异丙醇法提取叶、花、茎RNA产量低，完整性极差，这可能是由异丙醇沉淀RNA导致了多糖酚类物质的共沉淀造成的；CTAB-LiCl法则因其过于繁琐的操作步骤和耗时长的时间成本，导致RNA容易发生降解，在实际操作中提取的RNA得率低质量差；试剂盒法经济成本最高，多花黄精含量过于丰富的多糖成分使得该法提取RNA得率低完整性差；热酚法提取的多花黄精叶、花、茎组织虽然浓度高，但有DNA污染，且根茎组织中提取的RNA完整性差。用改良热酚法提取得到的RNA不仅完整性好，而且质量高，符合提取多花黄精不同部位RNA的条件，可以较好地用于后续相关的的分子生物学实验。改良热酚法在热酚法的基础上改动了RNA沉淀剂并增加了纯化步骤，采用异丙醇沉淀RNA，节约了时间成本，后续用3 mol/L pH5.2醋酸钠和无水乙醇对RNA进行重沉淀，增加的纯化步骤削减了异丙醇沉淀RNA所带来的多糖酚类物质的共沉淀副作用，提高了RNA质量。应用隶属函数法能较全面地评价不同方法提取得到的总RNA质量，平均隶属函数值越大，表明提取的总RNA质量越佳，反之质量越差，分析结果表明，不同方法提取得到的总RNA质量优劣排序为改良热酚法＞热酚法＞CTAB-LiCl法＞CTAB-异丙醇法＞Trizol法＞试剂盒法。综上所述，改良热酚法适用于提取多花黄精不同组织的高质量RNA。

3材料与方法

3.1样品

供试多花黄精幼叶、嫩茎、根茎、花均采购于庆元县亿康农林科技有限公司种植基地，经浙江中医药大学药学院张水利教授鉴定为百合科(Liliaceae)黄精属(Polygonatum Mill.)植物多花黄精(Polygonatum cyrtonema Hua)。样品经液氮速冻后，置于-80℃冰箱保存备用。

3.2仪器与试剂

HH420电热恒温水浴槽，上虞道墟茂祥仪器设备厂；MiniT-H2C三联多用途金属浴，杭州奥盛仪器有限公司；Beckman 64R Centrifuge型高速冷冻离心机，美国Beckman Coulter公司；XW-80A旋涡混合器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；Nanodrop 2000超微量分光光度计，赛默飞世尔科技公司；DYY-8C型双稳定时电泳仪，北京市六一仪器厂；Master cycler Pro S型梯度PCR仪，德国Eppendorf公司；天能4100全自动数码凝胶成像分析系统，上海天能科技有限公司。

Trizol试剂，Ambion公司；异戊醇，上海市试剂一厂；Tris-HCl、十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵，美国Amresco公司；乙二胺四乙酸，上海化学试剂采购供应五联化工厂；β-巯基乙醇，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；聚乙烯吡咯烷酮，美国Sigma-Aldrich公司；亚精胺，南京奥多福尼生物科技有限公司；Tris-硼酸，天根生化科技有限公司；氯仿，西陇化工股份有限公司；水饱和酚，北京应成基业化工有限责任公司；天根RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司；醋酸钠，温州润华化工实业公司；焦炭酸二乙酯，北京索莱宝科技有限公司；无水乙醇，杭州龙山精细化工有限公司；氯化锂，天津科密欧化学试剂有限公司；异丙醇，天津科密欧化学试剂有限公司。

3.3实验方法

Trizol法：参照吴凯朝等(2012)的方法。(1)取200~300 mg多花黄精组织在液氮中研磨成粉末，快速加入600 µL Trizol试剂，充分混匀后置冰浴中5 min后，在4 ℃、12 000 r/min下离心10 min。取上清液于新离心管中，加入五分之一体积三氯甲烷，充分混匀后冰浴5 min，4 ℃、12000r/min条件下离心20 min。(2)取上清液置于新离心管中，加入等体积的预冷异丙醇，冰浴10 min，4 ℃、12 000 r/min，离心10 min。弃上清液，留沉淀。(3)在上清液中加入8.0 mol/L LiCl溶液，使其终浓度为2.0 mol/L，放置4 ℃过夜，4 ℃、12 000 r/min，离心10 min。弃上清，75%乙醇洗涤沉淀，加入500 µL的SSTE缓冲液使沉淀溶解，再加入500 µL氯仿∶异戊醇(24: 1)并进行抽提，使无水乙醇完全沉淀。(4)用1 mL 75%乙醇(用DEPC配制，4 ℃预冷)洗涤沉淀，在4 ℃、12 000 r/min条件下离心3 min；弃废液，晾干后用40 µL DEPC溶解，贮存于- 80℃备用。

CTAB-LiCl法：参照孟丽等(2006)的方法。(1)取200~300 mg多花黄精组织在液氮中充分研磨至粉末状,迅速加入600 µL 65℃预热CTAB提取液,立即涡旋振荡，65 ℃水浴5 min,期间振荡3～5次。(2)冷却后加入等体积氯仿/异戊醇振荡混匀，在室温，12 000 r/min条件下离心15 min，转上清液至新离心管。(3)重复(2)中的操作。(4)在转移至新离心管中的上清中加入(1/3体积)8 mol/L LiCl，使终浓度为2 mol/L，4 ℃过夜。(5)在4 ℃ 10 000 r/min条件下离心20 min，弃上清，用1 mL 70%乙醇洗涤沉淀，晾干，加入500 µL SSTE缓冲液使沉淀溶解，再次加入500 µL的氯仿/异戊醇，抽提2次。取上清液加入1 mL无水乙醇，于-70 ℃放置30 min以上。(6)在4 ℃ 12 000r/min条件下离心20 min。沉淀先后用1 mL 70%乙醇、1 mL无水乙醇洗涤沉淀后，晾干，用40 µL DEPC水溶解。

CTAB-异丙醇法：方法参照“CTAB-LiCl法”，沉淀RNA步骤改为采用“加入等体积的异丙醇，混匀，插冰上静置30 min”。

热酚法：参照司爱君等(2012)的方法提取。(1)取200~300 mg多花黄精组织，加液氮研磨后加入1 mL 65℃预热的提取液，涡旋震荡混匀；(2)加1/2体积氯仿/异戊醇(24: 1溶液)，振荡混匀，在4 ℃、12 000 r/min条件下离心15 min；(3)取上清液置于新离心管中，加入上清液1/3体积的10 mol/L LiCl，-20 ℃条件下放置1.5 h；(4)在4 ℃ 12 000 r/min条件下离心30 min，弃上清，500 µL浓度为200 mmol/L NaCl将沉淀悬浮，加入500 µL水饱和酚，振荡混匀，冰浴10 min；(5) 4 ℃ 12 000 r/min，离心15 min，取上清液于新的离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24: 1)溶液，混匀后，冰浴10 min；(6)4、12 000 r/min，离心10 min，取上清液至新的离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，-20 ℃条件下放置30 min；(7)4 ℃ 12 000 r/min，离心10 min，弃上清，75%乙醇洗涤2次，置超净工作台晾干，用40 µL DEPC水溶解，存于-80 ℃备用。

天根RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒法：参照天根RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒说明书进行。

改良热酚法：(1)在80 ℃金属浴中预热400 µL水饱和苯酚和400 µL RNA抽提缓冲液(0.1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0), 0.1 mol/L LiCl, 0.01 mol/L EDTA (pH 8.0), 1.0% SDS)的混合溶液；(2)在液氮中研磨200~300 mg多花黄精样品，充分研磨后，将样品转移至1.5 mL预先冷却的离心管中，之后迅速往里加入预热好的80 ℃混合溶液，剧烈混匀，加入400 µL氯仿，冰上静置15 min；(3)在4 ℃ 12 000 r/min条件下离心20 min，取上清液置于新离心管，等体积的异丙醇，混匀，插冰上静置30 min；(4)在4 ℃ 12 000 r/min条件下离心20 min，弃上清液。加入360 mL DEPC水、40 mL 3 mol/L醋酸钠(pH 5.2)和800 mL无水乙醇，混匀，于-20 ℃静置2 h；(5)在4 ℃ 12 000 r/min条件下离心15 min，弃上清液；(6) RNA沉淀分别用1 mL 70%和100%乙醇各洗涤一次，等其在超净工作台干燥后溶于40 mL DEPC水中，并保存于-80 ℃冰箱中备用。

总RNA纯度和产量测定：吸取2 µL RNA样品，用Nanodrop 2000超微量分光光度计测RNA的浓度、OD₂₆₀/OD₂₈₀以及OD₂₆₀/OD₂₃₀值。

总RNA完整性分析：采用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测提取得到的RNA完整性。精密吸取5 μL多花黄精RNA样品，与1 μL 10×Loading Buffer混匀点样。电泳条件为电压120 V，时间30 min。电泳结果在凝胶成像系统中拍照记录。

数据分析：采用Excel和SPSS 20.0软件对数据进行统计分析，应用隶属函数法(孟丽等, 2006; 刘小艳等, 2010; 吴凯朝等, 2012;司爱君等, 2012; 徐率等, 2018)综合评价不同方法提取得到的总RNA得率和纯度。评价指标值与RNA得率呈“S”型曲线关系(正相关)，与OD₂₆₀/OD₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₃₀值成抛物线关系。RNA得率的计算公式为(1)，RNA OD₂₆₀/OD₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₃₀值的计算公式为(2)：

式中，x为指标测定值，X_max、X_min分别为所有样品RNA得率的最大值和最小值。

作者贡献

张颖和罗晓朦是本研究的实验操作、数据分析及论文初稿写作的执行人；罗兴菊参与实验采样和实验操作；张水利、汪红和张春椿参与实验指导和数据分析；范慧艳为本项目的构思者及负责人，指导实验设计、数据分析、论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢

本研究由浙江省基础公益研究计划项目(LGN20C140003)、浙江中医药大学中药学学科科研开放基金(Yao2016010)、浙江中医药大学中青年科研创新基金项目(KC201908)和浙江省中药资源普查项目(17-21209)共同资助。感谢浙江中医药大学中医药科学院医学科研中心公共平台提供的技术协助。

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